阿法替尼afatinib和TMZ组合治疗可减少细胞增殖

　　已知 EGFRvIII 可增加癌细胞的增殖、存活和调节治疗反应。我们通过蛋白质印迹分析验证了 EGFR、EGFRvIII 和 EGFRvIII DK 在 U87MG 和 U251 细胞中的表达。,并通过 MTT 法分析增殖率。与之前的报告一致 ，我们观察到与亲本 U87MG、EGFR 和 EGFRvIII DK 过表达细胞相比，U87EGFRvIII 细胞的增殖显着增加（p < 0.0001）。。为了分析 TMZ 和阿法替尼对 GBM 的细胞毒作用，U87MG 和 U87EGFRvIII 细胞用不同浓度的 TMZ（10-500 μM）或阿法替尼（0.25-5.0 μM）处理 48-72 小时，并通过 MTT 法进行分析。在 TMZ 和阿法替尼治疗后观察到 GBM 细胞活力的剂量依赖性降低。TMZ（替莫唑胺）的 25% (IC 25) 值抑制浓度约为 25 μM 和 300 μM，而阿法替尼（afatinib）对 U87MG 和 U87EGFRvIII 细胞的抑制浓度分别为 2 μM 和 1 μM。最近，对 35 名 GBM 患者的药代动力学分析显示，大约 10–25 μM 浓度的 TMZ 达到脑脊液 (CSF) 因此，为了模拟体内条件，我们在所有体外实验中使用了 25 μM TMZ 和 1 μM 阿法替尼。因此，我们的 CI 图显示，在 U87EGFRvIII 细胞中，阿法替尼与 TMZ 联合使用后，细胞活力出现了额外且近乎协同的降低。

　　集落形成测定显示，与载体处理的对照细胞相比，阿法替尼和 TMZ 均显着降低了 GBM 细胞 U87MG、U87EGFR WT、U87EGFRvIII 和 U87EGFRvIII DK 的克隆形成性。在 U87MG、U87EGFR WT 和 U87EGFRvIII DK 细胞中，TMZ 比阿法替尼更能抑制集落形成，而 U87EGFRvIII 细胞则相对耐药。然而，阿法替尼与 TMZ 联用消除了 U87EGFRvIII 细胞的集落形成能力。与载体处理的对照相比，TMZ (p= 0.01)、阿法替尼 (p= 0.03) 和 TMZ 加阿法替尼 (p= 0.01)的 U87MG 细胞集落形成百分比减少 96.3 ± 0.3、58 ± 6.2、98.4 ± 0.7， 分别。与对照组相比，TMZ、阿法替尼和联合组的 U87 EGFR WT 集落形成减少百分比分别为 66.5 ± 1.8、41.4 ± 1.9 和 80.5 ± 1.2 (p= 0.001），分别。U87EGFRvIII 比 U87MG、U87EGFR WT 和 U87EGFRvIII DK 细胞形成更大的集落。

　　同样，与对照组相比，TMZ-、阿法替尼-和联合治疗组由 U87EGFRvIII 形成的菌落平均百分比减少分别为 89.6 ± 3.0、56.6 ± 7.0 和 94.5 ± 0.6。此外，与单独使用 TMZ (p= 0.048) 或阿法替尼 (p= 0.005) 相比，阿法替尼加 TMZ 显着减少 EGFRvIII 菌落。与对照组相比，TMZ（ p= 0.02）、阿法替尼（p = 0.02）和联合组（p = 0.01）的 U87EGFRvIII DK 集落形成百分比分别为 85.0 ± 2.3、78.3 ± 1.5 和 95.3 ± 0.3 （p = 0.01）。总体而言，与单独使用 TMZ 相比，联合治疗显着降低了 U87MG、U87EGFR WT 和 U87EGFRvIII 集落生长（p= 0.01）。对于 U251 和 U251EGFRvIII GBM 细胞观察到类似的结果（数据未显示）。

　　我们分析了阿法替尼是否可以阻断 U87EGFRvIII 细胞的锚定非依赖性生长，因为 EGFRvIII 在癌细胞增殖中起重要作用，而锚定非依赖性生长可预测体内致瘤性。TMZ 显着降低了 U87MG、U87EGFR WT 和 U87EGFRvIII DK 中的集落大小以及集落数量，而 TMZ 对 EGFRvIII 细胞的影响较小。TMZ 单独或与阿法替尼联合使用也显着减少了 U87MG 小菌落 (p= 0.03) 和大菌落 (p= 0.02) 的数量。TMZ 和阿法替尼分别显着降低了 U87EGFR WT 大集落的数量（p= 0.05)，而 TMZ 和阿法替尼联合使用显着减少了小菌落 (p = 0.03) 和大菌落 (p = 0.03) 的数量。

　　阿法替尼或联合治疗显着减少了 U87EGFRvIII 小 [(阿法替尼(p = 0.02)；联合 (p = 0.01)] 和大菌落 (阿法替尼(p = 0.02)；联合 (p = 0.01)) 的数量。TMZ 或阿法替尼或联合治疗显着减少U87EGFRvIII DK小菌落数（p = 0.03），而TMZ和联合治疗显着减少大菌落数量[TMZ（p= 0.048）；联合治疗（p= 0.038）]。总体而言，联合治疗无论 EGFR 的激活状态如何，阿法替尼治疗都完全消除了 GBM 细胞的不依赖贴壁的生长。更多详情可咨询下方微信。