索拉非尼(Sorafenib)是人类RUVBL2的抑制剂

　　RUVBL1 和 RUVBL2 是高度保守的 ATP 酶，属于 AAA+（与各种细胞活动相关的 ATP 酶）超家族，参与各种复合物和细胞过程，其中一些与肿瘤发生密切相关。这些蛋白质与 DNA 损伤信号传导和修复、染色质重塑、端粒酶活性以及调节原癌基因（如 c-Myc 和 β-catenin）的转录活性有关。此外，发现这两种蛋白质在几种不同类型的癌症中过度表达，例如乳腺癌、肺癌、肾癌、膀胱癌和白血病。鉴于 RUVBL 蛋白在致癌作用中的各种作用和强烈参与，它们被认为是发现和开发治疗性癌症药物的新靶点。这里，我们描述了索拉非尼（Sorafenib）作为人类 RUVBL2 ATPase 活性的新型抑制剂的鉴定。酶动力学和表面等离子体共振实验表明，索拉非尼是蛋白质 ATP 酶活性的弱混合非竞争性抑制剂。尺寸排阻色谱和小角 X 射线散射数据表明，索拉非尼与 RUVBL2 的相互作用不会对蛋白质的溶液构象产生显着影响。

　　然而，数据表明索拉非尼对 RUVBL2 活性的影响是由蛋白质中的插入结构域介导的。索拉非尼还抑制 RUVBL1/2 复合物的 ATPase 活性。因此，我们建议可以进一步优化索拉非尼，使其成为 RUVBL 蛋白的有效抑制剂。酶动力学和表面等离子体共振实验表明，索拉非尼是蛋白质 ATP 酶活性的弱混合非竞争性抑制剂。尺寸排阻色谱和小角 X 射线散射数据表明，索拉非尼与 RUVBL2 的相互作用不会对蛋白质的溶液构象产生显着影响。

　　如前所述，不同的研究小组表明，人类 RUVBL 蛋白是肿瘤发展和转移的关键参与者。这些蛋白质的 ATPase 活性对于它们在癌症进展中的大部分作用至关重要。因此，我们有兴趣寻找 RUVBL 蛋白的抑制剂，更具体地说是 RUVBL2，因为它比 RUVBL1 表现出更高的 ATPase 活性。我们的筛选使我们发现索拉非尼是人类 RUVBL2 的抑制剂。

　　酶抑制剂可以归类为不可逆的，当它们与靶蛋白紧密或共价结合时，以及可逆的，当抑制剂可以从酶 - 抑制剂 (EI) 复合物上被替代时，例如，与天然酶底物竞争。 在可逆抑制剂中，竞争性（与底物结合，形成 EI 复合物）、非竞争性（与底物结合位点以外的位点结合，形成 ESI 或 EI 复合物）和非竞争性抑制剂（与底物结合，形成 EI 复合物）可以找到底物结合位点以外的位点，形成 EI 复合物并阻止底物结合）。索拉非尼（Sorafenib）对 RUVBL2 ATPase 的抑制被确定为混合非竞争性，表明索拉非尼可能不直接与 ATP 酶袋结合，但可能通过与不同基序的相互作用导致构象变化，这可能影响，例如，ATP 与 RUVBL2 的结合或 ADP 的释放。对 RUVBL2ΔDII 进行的进一步实验证实，截断插入域的 RUVBL2 的 ATPase 活性不受索拉非尼的抑制；因此，我们提出索拉非尼的作用机制是通过其与 DII 的相互作用介导的，或者 DII 的灵活性导致 RUVBL2 填充索拉非尼可以结合的某些构象。最近，有人提出 RUVBL2 N 端片段可能作为核苷酸结合位点的盖子，ATP 的结合可诱导 N 端片段募集 DII。从这个意义上说，索拉非尼与 DII 的结合会影响 DII 的动力学，从而影响 RUVBL2 核苷酸交换率。

　　我们的工作表明插入域 (DII) 对人类 RUVBL 蛋白的 ATP 酶活性具有调节作用。DII 的这种作用最初在 2011 年发表的一项研究中得到强调，该研究表明 DII 由于其灵活性而具有自身抑制功能，因为它的截断导致 RUVBLs 的 ATPase 活性增强。然而，应该注意的是，在我们的研究中，我们没有看到 RUVBL2ΔDII ATPase 相对于 RUVBL2 WT 的增强。差异可能归因于用于蛋白质纯化的方法、纯化标签的类型以及标签的存在/不存在。

　　索拉非尼（Sorafenib）是FDA批准用于治疗晚期肾细胞癌和肝细胞癌的口服药物，其对其他肿瘤类型如乳腺癌、肺癌和结肠癌的作用已有报道。它是一种多激酶抑制剂，靶向 Raf 丝氨酸/苏氨酸激酶（Raf-1、WT BRAF 和致癌 BRAF V600E）和受体酪氨酸激酶（VEGFR 1-3 和 PDGFR），这解释了其通过各种不同肿瘤类型的广泛活性抗增殖、抗血管生成和促凋亡等作用机制。索拉非尼与 Raf-1、WT BRAF 和 BRAF V600E 的 X 射线晶体结构已发表，表明索拉非尼是一种变构抑制剂，可与 Raf 激酶的激活片段 Asp-Phe-Gly (DFG) 结合。

　　Raf 激酶以两种构象之一存在；一种是称为“DFG Asp-out”构象的非活性状态，其中苯丙氨酸侧链占据 ATP 结合口袋，而天冬氨酸侧链远离活性位点。另一种是活性构象，称为“DFG Asp-in”构象，其中苯丙氨酸残基旋转出 ATP 结合口袋，而天冬氨酸残基面向 ATP 结合口袋。索拉非尼与 DFG 基序结合并将其锁定在 DFG Asp-out 状态，从而使激酶失活。索拉非尼的 IC50Raf1 激酶的值为 6 nM，p38α 激酶的值为 57 nM 。

　　我们的研究表明，索拉非尼对 RUVBL2的 IC50为 3.1 μM；因此，与对激酶的影响相比，索拉非尼是一种弱得多的 RUVBL2 抑制剂。因此，需要对索拉非尼进行化学修饰并进一步筛选，以制造出更好的 RUVBL2 抑制剂的索拉非尼类似物。此外，考虑到非竞争性作用模式，索拉非尼（Sorafenib）可能提供支持药物联合策略的机会，特别是因为索拉非尼是一种已经获得 FDA 批准的药物，因此，临床前和临床试验将更容易进行。微信扫描下方二维码了解更多：