希爱力/他达拉非短期治疗幼鼠长骨发育的分析

　　环 GMP (cGMP) 是软骨内骨生长和骨骼重塑的重要细胞内调节剂。希爱力/他达拉非是一种特异性水解 cGMP 的 5 型磷酸二酯酶 (PDE) (PDE5) 抑制剂，越来越多地用于治疗患有肺动脉高压 (PAH) 的儿童，但他达拉非对骨骼生长和强度的影响之前尚未研究过。在这项研究中，我们首先分析了新生大鼠骨骺软骨细胞原代培养物中编码 PDE 的转录本的表达。我们检测到 PDE5 作为主要的磷酸二酯酶水解 cGMP 的强烈表达。时程实验表明，C型利钠肽增加了原代软骨细胞中cGMP的细胞内水平，在2分钟达到峰值，在他达拉非存在下，细胞内cGMP的峰值水平高出37%。P< 0.01) 且下降显着减弱。接下来，我们用载体或他达拉非治疗 1 个月大的 Sprague Dawley 大鼠 3 周。尽管 10 mg·kg-1·day-1他达拉非导致cGMP 组织水平显着增加 52% (P< 0.01) 和减少 9% (P < 0.01) 在体重增加方面，它不会改变长骨长度、皮质骨或骨小梁特性以及组织学特征。总之，我们的结果表明 PDE5 在生长板软骨细胞中高度表达，并且以与 PAH 儿童使用的剂量相当的剂量对生长大鼠进行短期他达拉非治疗对长骨生长既没有明显的有益作用，也没有任何可观察到的不利影响。生长板结构和小梁和皮质骨结构。

　　美国心脏协会 (AHA) 和美国胸科学会 (ATS) 最近的指南推荐使用 PDE5 抑制剂，包括他达拉非，用于治疗小儿 PAH。尽管迄今为止没有报道希爱力/他达拉非对患者骨骼的不良（或有益）影响，但儿童 PAH 的低流行率以及 PAH 本身对正常生长的不利影响，使得很难评估这些药物对患者骨骼的潜在临床影响。骨骼发育和身高增长。这种不确定性促使我们使用青春期大鼠来研究他达拉非治疗是否与生长板发育和长骨结构的变化有关。据我们所知，我们的细胞培养研究是对软骨细胞中表达的 PDE 亚型的首次综合分析，我们的大鼠实验是首次验证他达拉非对骨骼影响的临床观察的动物研究。

　　尽管希爱力/他达拉非在体外增强了 CNP 诱导的 cGMP 在软骨细胞中的积累，这可能会预测软骨内骨骼生长的改变或体内重塑，但我们没有发现他达拉非对年轻人骨骼影响的证据。大鼠使用的剂量（2.5 和 10 mg·kg-1·day-1）与儿科患者的 AHA/ATS 建议剂量 0.5–1 mg·kg-1·day-1相当或略高。相比之下，我们的他达拉非治疗可有效抑制生长大鼠的体重增加，这种效应归因于增加的 cGMP 通过诱导棕色脂肪细胞分化和原代白色脂肪细胞“变褐”来增强能量消耗的能力，从而提供证据证明我们的给药方案能够产生药理作用。我们设想了几种可能的解释来解释他达拉非的治疗剂量无法影响骨骼发育。首先，由于软骨的无血管性质，我们施用的希爱力/他达拉非的剂量可能太低而无法在生长板软骨细胞中达到药物的有效浓度。在我们的实验中，我们观察到在脑组织中 cGMP 浓度上调方面的剂量依赖性效应，并且如上所述，实现了公认的减轻体重的生理终点。尽管较高剂量的他达拉非可能会影响骨骼，但这些剂量将超过目前他达拉非的处方量，因此不会产生临床后果。第二，其他 PDEs，如 PDE1、2、3 和 10，它们在原代软骨细胞中的表达水平远低于 PDE5，可能在体内发挥显着作用，并补偿他达拉非诱导的软骨细胞中 PDE5 活性的丧失，从而防止细胞内 cGMP 的增加。先前的一项研究表明，在 ATDC5 软骨细胞（小鼠 129 畸胎癌 AT805 衍生）中，PDE1，一种钙钙调素刺激的 PDE，在 cGMP 水解中起重要作用。与这一观点一致，我们发现在存在 IBMX（一种 PDE 的普遍抑制剂）的情况下，CNP 诱导的软骨细胞原代培养物中 cGMP 的积累和维持比在存在他达拉非（一种 PDE5 特异性抑制剂）的情况下更大。第三，他达拉非可能会增加软骨细胞中的 cGMP 水平，但不会达到允许改变细胞行为或生长的程度。激活 NPR2 并导致骨骼过度生长的功能获得性突变与比正常值高 20 倍的细胞内 cGMP 水平相关，这远大于我们在原代软骨细胞中使用 IBMX 或他达拉非治疗观察到的 4 到 5 倍的增加。事实上，一项使用 riociguat（一种 sGC 变构刺激剂）治疗新生大鼠幼崽的单独研究得出了类似的结论，即通过提高 cGMP 水平有效治疗新生大鼠幼崽 PAH 的药物不会影响体内骨骼发育。

　　CNP/Npr/cGMP 信号通路不仅调节软骨稳态，还调节骨代谢。最近的一项研究表明，在小鼠中过度表达 CNP 会导致完整股骨的骨质流失，并由于骨转换增加而加速骨折愈合。较早时间点的一系列研究表明，在培养中，CNP 通过提高 cGMP 水平来刺激成骨细胞增殖、分化和矿化。然而，另一项体内研究发现，他达拉非在 2 个月大的小鼠中治疗 2 个月通过抑制 Wnt 诱导的成骨细胞生成来减少小梁骨量。该研究使用了极高剂量的他达拉非（45 和 75 mg·kg-1·day-1），这大大超过了人体等效剂量，并且可能会引起毒性作用。然而，在本研究中没有报告明显的生长板表型。CNP/Npr/cGMP 信号通路在破骨细胞生成中的作用也不清楚。尽管早期报告表明 CNP 增加了骨髓细胞混合物中的破骨细胞骨吸收，但另一项研究发现 CNP 对骨髓巨噬细胞的破骨细胞形成具有相反的抑制作用 。基于这些先前的研究，很可能我们无法证明我们对胫骨小梁骨和股骨皮质骨的 microCT 分析以及用他达拉非治疗 3 周的年轻大鼠胫骨静态组织形态测量学的任何变化代表他达拉非未能诱导骨细胞中细胞内 cGMP 的强劲增加与 CNP 一样高，导致骨形成或吸收活性的任何改变。

　　我们的研究有几个局限性。首先，本研究中使用的大鼠模型处于青春期。小儿 PAH 会影响与新生儿一样小的儿童。对希爱力/他达拉非的骨骼反应可能与年龄有关。其次，我们只研究了雄性大鼠，但儿科 PAH 对女性和男性都有影响。最后，我们让大鼠接触他达拉非的时间很短。然而，由于我们研究的目标是确定他达拉非对儿童的潜在影响，我们将大鼠接触他达拉非的时间限制为仅 3 周，相当于人类大约 2 年。虽然可能需要更长的治疗时间来识别他达拉非相关的骨骼变化，但我们认为，如果检测到这种影响应该是轻微的，并且更多地与成人而不是儿童相关。

　　总之，我们的结果提供了大鼠软骨细胞中 PDE 的综合基因表达谱。我们还证明，希爱力/他达拉非治疗 3 周，剂量高达 10 mg·kg-1·day-1，远高于多环芳烃儿童使用的剂量，对长骨生长（包括生长板）没有可观察到的影响生长大鼠的结构和小梁和皮质骨结构。因此，我们的研究表明，尽管 cGMP 在常用剂量下的骨骼调节中具有重要作用，但他达拉非不太可能影响正在发育的儿童的骨骼。微信扫描下方二维码了解更多：