密妥坦/米托坦治疗肾上腺皮质癌的耐药机制

　　米托坦/密妥坦是唯一被批准用于治疗肾上腺皮质癌 (ACC) 的药物。其临床应用受限于治疗期间复发的发生。为了研究体外的潜在机制，我们在这里生成了耐米托坦的细胞系。在用 70 μM 米托坦对 HAC-15 人肾上腺皮质癌细胞进行长期脉冲处理后，我们分离了处理过的细胞和对照的单克隆细胞群，并通过 MTT 测定评估了它们各自的米托坦敏感性。我们进行了外显子组测序和电子显微镜检查，进行了基因表达微阵列分析，并在存在和不存在米托坦的情况下确定了细胞内脂质浓度。脉冲处理后建立的克隆细胞系对米托坦具有抗性。与非抗性克隆不同，抗性克隆在米托坦处理期间保持正常的线粒体和核仁形态。抗性克隆在很大程度上共享结构和单核苷酸变体，表明具有共同的起源细胞。抵抗部分取决于细胞外脂蛋白，并且与细胞内脂质稳态的改变有关，包括游离胆固醇水平以及类固醇生成减少。通过基因表达分析，抗性细胞在包括类固醇代谢和转运、细胞凋亡、细胞生长和 Wnt 信号传导在内的途径中显示出深刻的改变。这些研究建立了一个ACC 中米托坦抗性的体外模型并指出潜在的分子机制。它们可能使未来的研究能够克服体外耐药性并改善体内ACC 治疗。

　　据我们所知，这项研究是第一个在 ACC 以及非耐药对照中建立米托坦/密妥坦耐药体外模型的研究。我们选择 HAC-15 细胞系作为本研究的理想候选者，这是基于其产生的肾上腺类固醇激素和克隆性。虽然最初被描述为一种新的原代肾上腺皮质细胞系，但 HAC-15 细胞现在被认为是最常用的 H295R 肾上腺皮质癌细胞系的克隆亚群。另一种常用的细胞系 SW13 可能来自转移性非肾上腺肿瘤并且由于缺乏类固醇产生而似乎不太有用。两种最近建立的 ACC 细胞系的米托坦敏感性仍有待确定。最近建立的异种移植模型显示出米托坦抗性；然而，缺乏非抗性对照阻止了它在本研究中的使用。

　　HAC-15细胞系的克隆性、从脉冲处理开始到生长恢复的时间跨度长、获得的耐米托坦/密妥坦细胞克隆的遗传谱高度相似以及高突变负荷都表明耐米托坦这里描述的细胞不是来自预先存在的抗性亚群，而是通过选择诱变产生的。一致地，先前从 H295R 细胞中分离侧群的努力没有产生抗性细胞。

　　先前的研究集中在 H295R 细胞对米托坦的短期反应上，在我们的研究中，这种影响在对照细胞的短期治疗中得到了很大程度的复制。我们的微阵列数据表明，参与类固醇激素途径的基因表达下调，未折叠蛋白反应基因上调，与之前的数据一致。我们研究中差异表达基因的数量较少可能与不同的治疗持续时间有关（Sbiera等人的研究中为 6 小时，而我们的研究中为 18 小时）。

　　然而，这项研究的重点是米托坦/密妥坦抗性的体外机制。形态学分析表明线粒体损伤是米托坦处理的 H295R 细胞的一个显着特征，在米托坦处理的抗性细胞中不存在。这些发现表明改变的通路位于线粒体损伤的上游。因此，基因表达分析和功能研究都指向脂蛋白和脂质稳态的变化。通过基因表达微阵列，我们发现了与类固醇代谢有关的通路的下调，以及 ERK 的调节、凋亡细胞清除和对异生素的反应，这些共同可能导致抗性表型。与基因表达变化相关的拷贝数变化与米托坦信号无关，表明基因表达的调节而不是 CNV 可能起作用。

　　与非耐药对照不同，细胞内游离胆固醇——米托坦/密妥坦相关细胞凋亡的主要介质——在米托坦处理后在耐药细胞中保持不变。我们确认了 Hescot等人的数据。和 Kroiss等人。证明脂蛋白结合在体外抑制米托坦活性。重要的是，在我们的研究中去除细胞外脂蛋白对耐药细胞的敏感性比对非耐药细胞的影响更大。如果体内存在类似的机制，降低脂蛋白浓度可能是克服阻力的一种有前途的方法（见下文）。有趣的是，质谱表明在体外抗性细胞中肾上腺类固醇的产生强烈下调，因此，评估抗性发展后体内皮质醇增多症的任何减少是否持续将是有趣的。

　　我们研究的局限性包括使用体外细胞模型，它不能反映三维肿瘤结构或其微环境并且不能解释米托坦的代谢和排泄或在含脂肪组织中的储存。 理想情况下，我们的研究应该辅以米托坦耐药性的体内研究，比较米托坦治疗前和耐药性发展后的肿瘤材料。然而，由于 ACC 的罕见性，特别是在出现米托坦耐药性后接受再手术的病例，此类研究具有挑战性。此外，我们的结果应该谨慎解释，因为只研究了一个细胞系。

　　克服米托坦/密妥坦耐药性的潜在策略包括 SOAT 抑制剂，如 ATR-101 、抑制内质网伴侣或蛋白酶体抑制剂。值得注意的是，在我们的模型中，多柔比星在用米托坦处理的耐药细胞中比在非耐药对照中更有效，这一观察结果迄今为止仍未得到解释。如果适用于体内，这些结果将支持在米托坦单药治疗期间复发的情况下使用米托坦加多柔比星（作为 EDP-M 的一部分 ）。

　　如前所述，在我们的细胞模型中，可通过降低细胞外脂蛋白浓度来部分逆转米托坦/密妥坦抗性。这种效果特别重要，因为米托坦疗法会导致脂蛋白水平升高，从而可能促进耐药性。已经表明通过他汀类药物治疗降低脂蛋白水平与米托坦治疗期间更高的肿瘤控制率有关 。新型 PCSK9 抑制剂可能更有希望，因为它们能够在他汀类药物治疗之外降低 LDL 水平。因此，我们建议我们在这里建立的模型可能有助于制定在体外克服米托坦抗性的策略，然后可以在临床试验中进一步研究。微信扫描下方二维码了解更多：