索拉菲尼/索拉非尼抑制人类免疫细胞中的JAK-STAT信号转导

　　索拉非尼/索拉菲尼是一种口服多激酶抑制剂，最初是作为 Raf 激酶抑制剂开发的。我们假设索拉非尼也会对免疫细胞中的细胞因子信号通路产生抑制作用。来自正常供体的外周血单核细胞 (PBMC) 用不同浓度的索拉非尼处理，并用 IFN-α 或 IL-2 刺激。STAT1 和 STAT5 的磷酸化通过流式细胞术测量并通过免疫印迹分析确认。通过 qPCR 测量 IFN-α- 和 IL-2 刺激的基因表达的变化，并通过 ELISA 评估细胞因子产生的变化。在每天两次接受 400 mg 索拉非尼之前和之后，从癌症患者身上获得冷冻保存的 PBMC。患者 PBMC 被解冻，用 IL-2 或 IFN-α 刺激，并评估 STAT1 和 STAT5 的磷酸化。在用 IFN-α 或 IL-2 处理后，用 10 μM 索拉非尼预处理 PBMC 会降低 STAT1 和 STAT5 磷酸化。在索拉非尼 (5-20 μM)、IL-2 (2-24 nM) 和 IFN-α (101- 106U/mL)。这种效应在免疫细胞亚群中观察到，包括 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、调节性 T 细胞和髓源性抑制细胞。用索拉非尼预处理还抑制了 IFN-α 和 IL-2 调节基因的 PBMC 表达，并抑制了 IFN-γ、RANTES、MIP1-α 和 MIG 响应 IFN-α 刺激的 NK 细胞产生。接受索拉非尼治疗的患者的 PBMC 显示对 IL-2 和 IFN-α 治疗的反应性降低。索拉非尼是一种 Raf 激酶抑制剂，可能对免疫效应细胞中细胞因子诱导的信号转导产生脱靶效应。

　　我们假设索拉非尼/索拉菲尼通过免疫效应细胞中的 JAK-STAT 通路对 IL-2 和 IFN-α 信号转导产生脱靶效应。我们的研究确定了以下内容：首先，无论细胞因子浓度如何，在体外应用于 PBMC 的索拉非尼治疗浓度足以抑制 STAT1 和 STAT5 分别响应 IFN-α 和 IL-2 刺激的磷酸化。其次，先前用索拉非尼治疗会降低通常由 IFN-α 和 IL-2 刺激的基因表达以及免疫细胞细胞因子的产生。第三，索拉非尼对几乎所有免疫细胞区室都有影响，包括具有免疫抑制作用的免疫细胞，如调节性 T 细胞和 MDSC。最后，索拉非尼体内疗法在用 IFN-α 和 IL-2 刺激后，导致 STAT1 和 STAT5 的磷酸化降低。

　　虽然之前的研究表明索拉非尼/索拉菲尼治疗会降低免疫细胞的激活和功能，但这些研究都没有检查特定机制，例如索拉非尼对细胞因子信号传导的影响。其他研究已经寻找索拉非尼对 Raf/Ras/MEK 通路（该药物的设计靶点）影响的证据。本研究首次研究了索拉非尼治疗对免疫细胞中 JAK-STAT 信号通路的直接影响。使用细胞内流式细胞术，表明在体外用治疗浓度的索拉非尼对 PBMC 进行预处理导致 IL-2、IFN-α 和 IFN-γ 信号中间体的磷酸化降低。这些发现通过免疫印迹分析得到证实，并且还证明了 IL-6 诱导的 STAT3 磷酸化降低。重要的是要注意，虽然免疫印迹结果与流式细胞术的发现并不完全相关，但这是两种不同的检测方法，采用不同的方法来制备细胞。此外，之前已经确定，通过流式细胞术测量的磷酸化 STAT1 的总水平与由 STAT1 与特定启动子区域的结合驱动的 IFN 刺激基因的转录直接相关 。重要的是，我们已经确定这种现象适用于体外多个免疫亚群在一小部分癌症患者中。

　　索拉非尼对 IL-2 和 IFN-α 信号传导的抑制作用是显着的，因为这些细胞因子在启动有效免疫反应中的重要性，特别是在索拉非尼生理相关浓度下观察到信号传导抑制时。虽然在本研究中仅评估了 IL-2、IFN-α 和 IFN-γ 信号传导，但抑制依赖于通过 JAK-STAT 通路信号传导的其他细胞因子的活性是可能的。事实上，探索性研究表明，索拉非尼还抑制了 PBMC 中 IL-21 诱导的 JAK-STAT 信号转导。抑制机制可能涉及对 JAK 活性的影响。最近的观察表明，虽然 JAK1 的总水平不受索拉非尼的影响，但 JAK1 的磷酸化在胶质母细胞瘤细胞系中受到显着抑制。类似地，IL-6 诱导的 STAT3 和 JAK2 磷酸化在神经母细胞瘤细胞系中被索拉非尼抑制。尽管进行了大量努力，但我们对索拉非尼处理细胞中 JAK1 活性的分析并未得出抑制 PBMC 中 JAK1 激活的确凿证据。基于上述研究，我们提出索拉非尼通过抑制 JAK 来抑制细胞因子诱导的 JAK-STAT 激活。索拉非尼对其许多靶激酶的作用已被证明是可逆的。然而，虽然一些免疫细胞在接触索拉非尼并随后清洗后能够恢复细胞因子信号传导，但与未经索拉非尼预处理的免疫细胞相比，这些细胞中有一小部分对细胞因子刺激有反应。这一发现表明，去除索拉非尼后，该途径的抑制并不容易消除。因此，索拉非尼可能会抑制基线免疫功能以及基于细胞因子的免疫疗法。相比之下，已显示 Braf 抑制剂 PLX4032 对 CD8+T 细胞中 STAT1、3、5 和 6 的磷酸化影响最小。

　　这与其他数据一致，表明索拉非尼/索拉菲尼治疗已被发现降低了 PHA 刺激后 T 细胞上 CD25 和 CD69 的表达，并且它还抑制了 LPS 刺激后树突状细胞上 II 类 MHC 和 CD80 的表达。活化标志物表达的降低伴随着 T 细胞中 Lck 和 Erk 磷酸化的降低以及树突细胞中 MyD88 通路活性的降低。索拉非尼预处理还抑制受刺激的 T 细胞 (IL-2) 和树突状细胞 (IL-6、IL-12、IL-10 和 TNF-α) 产生的细胞因子。有趣的是，在另一项研究中，发现索拉非尼可以逆转 VEGF 对未成熟髓细胞向树突细胞转变的抑制作用。体内研究探讨对T细胞介导的反应索拉非尼的效果表明在接触性皮炎的严重程度的降低和免疫后一个抗原特异性CD8 + T细胞的诱导降低，提示在免疫细胞信号传导的抑制有功能后果在体内。因此，多项研究表明，索拉非尼可以改变免疫细胞功能。我们的研究现在表明细胞因子信号传导也受损，从而为这些观察提供了一个潜在的机制。

　　尽管在我们的研究中测试独特患者样本的重复次数不多，但本研究表明索拉非尼/索拉菲尼抑制响应外源性细胞因子的信号转导，这也可能扩展到内源性细胞因子信号传导。索拉非尼还对关键免疫细胞具有抑制作用，包括免疫抑制免疫亚群。因此，如果索拉非尼与免疫刺激性细胞因子联合使用，则必须仔细考虑索拉非尼的给药时机。此外，索拉非尼可用作改变抑制性免疫细胞亚群（例如调节性 T 细胞和 MDSC）活性的手段。微信扫描下方二维码了解更多：