米哚妥林(midostaurin)在肺癌细胞中的复杂作用机制

　　肺癌与高患病率和死亡率相关，尽管靶向药物在基因组定义的肺癌亚组和免疫疗法中取得了巨大成功，但大多数患者目前并未从这些疗法中受益。通过靶向药物筛选，我们发现最近批准的多激酶抑制剂米哚妥林（midostaurin）在几种肺癌细胞中具有强大的活性，而与其预期目标、PKC 或特定基因组标记无关。为了确定潜在的作用机制，我们应用了分层功能蛋白质组学方法和新的数据集成方法。使用化学蛋白质组学，我们在这些细胞中鉴定了多个米哚妥林（midostaurin）激酶靶点。使用来自 STRING 数据库的蛋白质-蛋白质相互作用将这些靶标与定量酪氨酸和全局磷酸化蛋白质组学数据进行基于网络的整合，表明多个靶标与米哚妥林（midostaurin）的作用模式相关。随后使用 RNA 干扰和选择性小分子探针进行的功能验证表明，需要同时抑制 TBK1、PDPK1 和 AURKA 才能引发米哚妥林（midostaurin）的细胞效应。下游信号节点的免疫印迹分析表明，这些靶标的联合抑制改变了 PI3K/AKT 和细胞周期信号通路，这些通路部分会聚在 PLK1 上。此外，midostaurin 与强效 PLK1 抑制剂 BI2536 的合理组合引发了强烈的协同作用。我们的结果表明，互补的功能蛋白质组学方法和随后的基于网络的数据集成的结合可以揭示对多激酶抑制剂的复杂作用模式、药物发现的可操作靶点和癌症脆弱性的新见解。最后，我们说明了如何将这些知识用于合理设计具有临床转化潜力的协同药物组合。

　　尽管基因组学取得了巨大进步，精准医学也取得了相关成功，但大多数癌症，包括许多 NSCLC 肿瘤，目前并未显示出可操作的突变，因此迫切需要新的抗癌靶点。在 FDA 批准的多激酶抑制剂米哚妥林（midostaurin）在 NSCLC 细胞中的无法解释的细胞活性的指导下，我们应用了一种综合功能蛋白质组学方法，包括化学蛋白质组学以及全局和酪氨酸磷酸蛋白质组学。该策略通过阐明midostaurin 的全网络信号效应和复杂的MoA 导致确定肺癌的新的可操作靶标。重要的是，与其他有效和选择性抑制剂相比，midostaurin 在这些细胞中的活性与其经典靶标 PKC 和 FLT3 无关。此外，我们发现米哚妥林（midostaurin）的MoA 取决于同时抑制至少三个不同的非经典目标。这一观察结果不仅构成了一个罕见而有趣的多药理学案例，但也有力地证明了应用无偏见的多层蛋白质组学方法和基于网络的分析来捕捉潜在机制的复杂性的必要性。该策略特别重要，因为这些细胞中的相关米哚妥林（midostaurin）靶标没有发生突变，因此对大多数基因组学方法“隐藏”，而且它们的贡献是基于它们在信号网络中的广泛影响。我们的研究结果进一步说明了将这些正交蛋白质组学技术结合起来的力量，因为化学蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析都不能轻易指定这种广泛的功能相关的目标和途径。

　　整合化学和磷酸化蛋白质组学数据集，对由此产生的米哚妥林（midostaurin）效应网络的深入挖掘和随后的功能验证突出显示了三种激酶作为这些 NSCLC 细胞中的相关 midostaurin 靶点，即 AURKA、PDPK1 和 TBK1。TBK1 是 IκB 激酶 ε (IKKε) 的密切同源物，最初被鉴定为在先天免疫反应中起作用，在这方面特别令人感兴趣，因为它最近被描述为在几个非小细胞肺癌中对突变KRAS具有合成致死性细胞系。值得注意的是，尽管这一发现已针对多种细胞系进行了独立验证，但后来对更广泛的 NSCLC 细胞系面板的研究报告了KRAS的一系列敏感性- 对 TBK1 沉默/抑制的突变 NSCLC 细胞系。这与我们的观察结果一致，即 TBK1 抑制仅导致这些特定 NSCLC 细胞系中的活力部分降低。米哚妥林（midostaurin）还在几种KRAS-wt 细胞中显示出活性，相反不影响许多其他KRAS突变的 NSCLC 细胞，包括一些对TBK1丢失敏感的细胞，例如 H23 细胞。这进一步说明了多靶点机制的重要性，因为在KRAS突变细胞中，米哚妥林（midostaurin）在 NSCLC 细胞中的细胞活性不能简单地减少为单独的 TBK1 抑制。TBK1 已显示在 T308 和 S473 处磷酸化 AKT，这与我们在 A427 细胞中的观察结果一致，尽管 BX795 对 TBK1 的抑制对 T308 的影响不那么明显。然而，PDPK1（另一个重要的midostaurin 靶标）的抑制也显着降低了T308 处的AKT 磷酸化，并进一步降低了S473 的下游，正如PI3K-AKT 信号级联的这种典型激活剂所预期的那样。一致地，midostaurin 治疗引起了类似的 T308 磷酸化抑制。然而，米哚妥林没有降低S473的磷酸化指示任一的mTOR反馈信令或抑制另一个在此阶段挽救影响的目标。此外，我们观察到明显抑制 AMPK 的 CAMKK2 介导的磷酸化，AMPK 是一种已知的肿瘤抑制因子和 mTOR 信号传导的负调节因子。尽管 AMPK 作为 mTOR 复合体 1 (mTORC1) 的一部分调节 mTOR，并且 AKT S473 是 mTORC2 靶位点，但最近表明，AMPK 激活还可以降低 NSCLC 细胞中的 mTORC2 活性和 AKT S473 磷酸化。有趣的是，最近的研究发现，AURKA的抑制可以克服mTOR抑制剂抗性在胃肠道肿瘤细胞和AURKA能抑制STK11（LKB1）/ AMPK在NSCLC细胞。这些数据与我们的发现一致，即 AURKA 抑制是米哚妥林（midostaurin）的 MoA 的主要组成部分，在STK11野生型细胞中可能更是如此。此外，我们观察到对其他重要 AURKA 下游信号的显着影响，即组蛋白 H3 S10 和 PLK1 T210 的磷酸化。与先前关于 PLK1 的报道一致，这些信号通过 TBK1 抑制进一步降低，尽管强度较低。虽然 PLK1 T210 也被提议作为 PDPK1 的底物，我们在 A427 细胞中没有发现这方面的证据，表明midostaurin 对 PDPK1 的抑制可能通过其他下游靶标促进这些细胞中的整体 MoA。正如在别处详细回顾的那样，PLK1 和 AURKA 已经很好地建立在有丝分裂和细胞分裂过程中参与多种功能相互作用。此外，它们在控制 G2/M 细胞周期检查点和有丝分裂进入方面发挥着关键作用，这与米哚妥林（midostaurin）治疗后 G2 中细胞的强积累非常吻合。有趣的是，最近有报道称 TBK1 也影响有丝分裂。

　　PLK1 和 AURKA 已被提议作为预后和癌症侵袭性的新标志物，以及作为几种癌症类型治疗干预的功能靶点。PLK1 在许多类型的癌症中失调，并与肿瘤发生有关。中度 PLK1 表达的 NSCLC 患者显示 51.8% 的 5 年生存率，而 PLK1 表达水平升高的患者则为 24.2%。基于已知的 PLK1 信号传导与癌症相关性以及 Midostaurin 仅部分抑制 PLK1 T210 磷酸化，我们评估了 Midostaurin 与强效 PLK1 抑制剂 BI2536 的组合，并在体外观察到强效临床相关药物浓度的协同作用。由于米哚妥林（midostaurin）最近被 FDA 批准用于 AML 并且 BI2536 目前处于 I 和 II 期临床试验，这种组合可能为米哚妥林（midostaurin）带来有吸引力的药物再利用机会。

　　总之，通过使用无偏的、分层的功能蛋白质组学和基于网络的数据集成的组合，我们能够阐明多激酶抑制剂米哚妥林（midostaurin）在肺癌细胞中的作用机制，该机制与其同源靶点无关，而是涉及几个非经典的米哚妥林（midostaurin）目标。对下游信号效应的分析确定了特定致癌途径的收敛性，这导致了新型协同药物组合的合理设计。这种集成蛋白质组学方法的成功应用表明它有潜力回答复杂的生物学问题，并揭示基因组学方法可能不明显的新的可操作的癌症弱点。微信扫描下方二维码了解更多：