肝癌中多吉美/索拉非尼耐药机制的新见解

　　多吉美/索拉非尼是过去十年中唯一获批的晚期肝细胞癌 (HCC) 一线全身治疗药物。肿瘤对索拉非尼的耐药性一直是提高 HCC 患者生存率的主要障碍。

　　方法

　　我们将 THP-1 细胞极化为 M1 和 M2 巨噬细胞，进行了各种体外测定并开发了索拉非尼抗性异种移植模型，以研究肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 分泌的分子在 HCC 对靶向治疗的抗性中的作用。

　　结果

　　我们证明了 M2（而非 M1）巨噬细胞不仅促进肝癌细胞的增殖、集落形成和迁移，而且通过分泌肝细胞生长因子 (HGF) 维持肿瘤生长和转移，显着赋予肿瘤对索拉非尼的抗性。HGF 激活肿瘤细胞中的 HGF/c-Met、ERK1/2/MAPK 和 PI3K/AKT 通路。肿瘤相关的 M2 巨噬细胞在索拉非尼耐药性肿瘤中的积累比在体内索拉非尼敏感的肿瘤中更多，并产生丰富的 HGF。HGF 化学吸引更多从周围区域迁移的巨噬细胞，调节 M2 巨噬细胞的分布，并以前馈方式增加肝癌对索拉非尼的耐药性。

　　结论

　　我们的研究结果提供了对 HCC 中多吉美/索拉非尼耐药机制的新见解，并为通过将索拉非尼与强效 HGF 抑制剂（如卡博替尼）联合以提高一线全身治疗效果而开展新试验的基本原理提供了依据。

　　巨噬细胞是 TME 的主要成分，主要从血液循环单核细胞中募集，并通过细胞因子 CSF-1、趋化因子 CCL2、CCL9、CCL17、CCL18 和骨膜素驻留在肿瘤组织 (TAM) 中。TAM 具有引发肿瘤破坏性反应（抗肿瘤活性）或驱动肿瘤发生、血管生成、转移和 T 细胞免疫抑制（促肿瘤活性）的潜力。在 HCC 中，TAM 在临床结果中的作用仍然存在争议，这可能是由于 TAM 的高可塑性和异质性。事实上，巨噬细胞能够分化为经典的（M1，镜像 TH1）和替代地（M2，镜像 TH2) 在功能谱连续谱的极端情况下，激活巨噬细胞。这些群体通常通过诱导刺激（例如 M1 的 CSF-1、LPS 和 IFN-γ；M2 的 GM-CSF、IL-4 和 IL-13）、分泌特征（例如，IL-12高、IL -6高、TNFα高和 CXCL9高M1；IL-10高和 TGF-β1高M2）、蛋白质标记（例如 M1 的 HLA-DR 和 NOS2；CD163、CD204/MSR1/SR-A、CD206 /MRC1、CD115/CSF-1R 和 M2 的 Arg1）和功能特征（例如，抗肿瘤或促肿瘤活性）。CD11b 和 CD68 是常用于识别泛单核细胞/巨噬细胞的标志物。

　　在 HCC 中已经证明 M2 巨噬细胞可以通过产生 IL-1β 和 HGF来改善 EMT 肿瘤转移，而 M1 巨噬细胞通过不同的整合素-Rho GTPase-Hippo 途径抑制肿瘤转移。有趣的是，最近有报道称索拉非尼通过在原位小鼠模型中通过 JAK-STAT3 信号传导下调 HTATIP2 表达来诱导 EMT 并促进 HCC 细胞的侵袭和转移。

　　我们研究了 TAM 在 HCC 多吉美/索拉非尼耐药中的作用。索拉非尼有效抑制肝癌细胞的生长、集落形成和迁移。有趣的是，M2-CM 显着减弱了索拉非尼抑制肝癌细胞生长、集落形成和迁移的能力，而 M1-CM 没有这种作用，

　　众所周知，TAM 会产生多种因子，其中一些因子，例如 CCL22 和 IGF-1，可能会导致多吉美/索拉非尼耐药。通过筛选 M1 和 M2 巨噬细胞之间差异的基因表达，我们发现 M2 巨噬细胞大量表达 HGF，并且比 M1 巨噬细胞分泌的 HGF 高约 30 倍。用重组人 HGF 替代 M2-CM 减弱了索拉非尼抑制肝癌细胞生长、集落形成和迁移的能力。向 M2-CM 添加抗 HGF 消除了 M2-CM 对索拉非尼的活性，表明 M2-CM 中的 HGF 通过维持肿瘤生长和转移，在 M2 巨噬细胞赋予的对索拉非尼的肝癌耐药中起主要作用。除了肿瘤相关的 M2 巨噬细胞，癌症相关的成纤维细胞和肝癌细胞，还会产生大量的 HGF，这可能有助于获得索拉非尼耐药性。为了进一步探索潜在机制，我们评估了肝癌细胞中 HGF/c-Met、ERK/MAPK 和 PI3K/AKT 通路中关键蛋白的表达和磷酸化。我们发现索拉非尼对 c-Met、ERK1/2 和 AKT 的蛋白表达以及 pMet 的磷酸化没有显着影响，但显着降低了 pERK/1/2 和 pAKT 的磷酸化，证实了索拉非尼在抑制ERK1/2/MAPK 通路通过靶向 RAF。M2-CM 或重组 HGF 与索拉非尼的组合显着增加了 c-Met 的表达和 pMet、pERK1/2 和 pAKT 的磷酸化；在 M2-CM 和索拉非尼的组合中加入抗 HGF 抗体与单独使用索拉非尼具有相同的效果。综上所述，结果表明（a）索拉非尼本身不影响 HGF/c-Met 信号传导，但通过靶向 RAF 抑制 ERK1/2/MAPK 信号传导，并通过 ERK1/2/MAPK 通路或其他机制抑制 PI3K/AKT 信号传导（ s);(b) M2 巨噬细胞分泌的 HGF 激活 HGF/c-Met 信号和下游 ERK1/2/MAPK 和 PI3K/AKT 通路。事实上，PI3K 已被证明与 HCC 的索拉非尼耐药有关。

　　在本研究中，我们发现 HGF 促进肝癌细胞和 M2 巨噬细胞的迁移，表明肿瘤相关的 M2 巨噬细胞分泌的 HGF 可能会招募更多的巨噬细胞进入肿瘤，调节 M2 巨噬细胞在肿瘤组织中的分布，从而增加肿瘤对肿瘤的抵抗力。索拉非尼前馈方式。我们通过在裸鼠中传代 HCC 细胞、用索拉非尼诱导治疗小鼠以及再次将小鼠传代的肿瘤细胞植入小鼠，进一步开发了异种移植索拉非尼耐药和索拉非尼敏感模型。我们发现 F4/80+/CD206+双阳性 M2 巨噬细胞在 SR 肿瘤中显着高于 SS 肿瘤。短期索拉非尼治疗降低 F4/80+/CD206+M2 巨噬细胞。但长期接触索拉非尼会增加 HGF 的合成和分泌，同时增加 c-Met 和 pMet 的水平。由于索拉非尼也是一种抗血管生成剂，因此在某些情况下，抗肿瘤作用可能与抗血管生成活性、非肿瘤不良反应甚至肿瘤转移相关。我们通过 CD31 染色检查了 SR 和 SS 肿瘤中的肿瘤血管系统。在 SR 肿瘤和 SS 肿瘤之间没有观察到内皮密度的显着差异，但 SR 肿瘤中存在的血管比 SS 肿瘤中的大，这表明这种较大的血管也可能导致索拉非尼耐药。

　　总之，我们证明了肿瘤相关的 M2 巨噬细胞而不是 M1 巨噬细胞会增加肝癌细胞的生长和迁移，通过分泌 HGF 赋予肝癌细胞对多吉美/索拉非尼治疗的抗性。M2巨噬细胞和肿瘤细胞的HGF激活肿瘤细胞中的HGF/c-Met、MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT通路，从周围血液循环中募集更多的巨噬细胞，调节M2巨噬细胞在肿瘤组织中的分布，增加肿瘤以前馈方式对索拉非尼产生耐药性。我们的研究结果为 HCC 中多吉美/索拉非尼的耐药性提供了新的见解，并提倡通过索拉非尼与强效 HGF 抑制剂（如卡博替尼）联合开发一线全身治疗的新试验，以提高一线全身治疗效果。

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