米托坦(mitotane)诱导的线粒体相关膜功能障碍

　　米托坦（mitotane）是治疗肾上腺皮质癌最有效的药物，它会集中到线粒体中并影响线粒体功能。为了解决米托坦作用的分子机制并确定其潜在靶标，在人肾上腺皮质 H295R 细胞中采用了代谢组学和脂质组学方法以及成像分析，允许将线粒体相关膜功能障碍鉴定为米托坦的关键影响。通过核磁共振光谱对细胞内能量代谢物的研究表明，米托坦显着降低天冬氨酸，同时以时间和浓度依赖性方式同时增加谷氨酸含量。这种改变很可能与之前描述的米托坦诱导的呼吸链缺陷有关。细胞内和线粒体内磷脂的脂质组学研究表明，米托坦暴露显着降低了磷脂酰丝氨酸/磷脂酰乙醇胺的比率，表明位于线粒体相关膜中的磷脂酰丝氨酸脱羧酶功能障碍。通过蛋白质印迹分析评估，线粒体相关膜蛋白磷脂酰丝氨酸脱羧酶、DRP1、ATAD3A 或 TSPO 的表达水平被米托坦大大降低。Mitotane 暴露显着改变了内源性线粒体相关膜的完整性，并降低了线粒体和内质网相互作用的量级，如高分辨率反卷积显微镜和量化所示。最后，我们展示了胆固醇转运蛋白 TSPO 的药理学抑制剂 PK11195，嵌入线粒体相关膜中，与米托坦在诱导线粒体相关膜破坏、细胞凋亡和抑制类固醇分泌方面发挥协同作用。总而言之，我们的结果表明用米托坦处理的 H295R 细胞中的线粒体相关膜功能障碍，并且 TSPO 抑制显着增强了米托坦的抗肿瘤和抗分泌作用体外。这构成了肾上腺皮质癌患者的潜在和有希望的药理学策略。

　　米托坦（mitotane）仍然是 ACC 最有效的治疗方法，但其分子作用机制尚不清楚，其分子靶点未知。先前已经证明，米托坦具有显着的线粒体影响，但该药物也会诱导 ER 损伤，导致 ER 应激。在本研究中，我们将 MAM 确定为米托坦作用的主要细胞内靶点。

　　我们之前通过免疫细胞化学表明，米托坦诱导线粒体网络断裂，并证明这伴随着呼吸链复合物 I 和 IV 活性的特异性抑制。最近，塔塞瓦等人。，观察到 siRNA 对 PSB-2 细胞中 PISD 表达的抑制是由低 PE 诱导的线粒体损伤的原因，包括呼吸抑制、钙摄取减少和线粒体断裂增加。由于这些相似的表型，我们通过补充方法研究了米托坦对 PISD 的影响，并证实米托坦通过蛋白质印迹抑制 PISD 蛋白表达，并通过脂质组学研究在人肾上腺皮质 H295R 细胞中抑制功能。PISD 位于 MAM 中，线粒体断裂等效应可能继发于 MAM 破坏。事实上，线粒体网络受到融合和裂变事件的动态调节，融合和裂变事件涉及不同的蛋白质，包括 DRP1（动力相关蛋白 1 型），也是 MAM 结构的组成部分。同样，米托坦降低 H295R 细胞中 DRP1 蛋白的稳态水平。令人惊讶的是，在相同的米托坦孵育条件下，PISD 和 DRP1 mRNA 水平显着增加（数据未显示）。然而，这里报告的肾上腺皮质细胞与米托坦的补偿作用仍有待进一步表征。我们的研究结果还表明，米托坦（mitotane）直接抑制一些但不是所有结构 MAM 驻留蛋白的表达。例如，在 50 μM 米托坦暴露 48 小时后，CYP11A1 或 VDAC 表达似乎没有显着改变。然而，先前已证明 VDAC 蛋白表达减少和 CYP11A1 表达在长时间暴露于米托坦 72 小时后降低。我们展示了使用免疫细胞化学和高分辨率去卷积显微镜，然后量化 Manders 和 Pearson 共定位系数，米托坦诱导 MAM 的破坏。 ER 应激是由先前报道的游离胆固醇细胞内含量的增加引起的，并且可能是由于 TSPO 和 ACAT1（也位于 MAM 中）受到抑制所致。最后，线粒体内 Ca2+浓度的增加与伴随的呼吸链缺陷相结合，导致活性氧 (ROS) 产生加速，是细胞凋亡的原因。

　　我们之前表明，细胞内的米托坦（mitotane）大量进入并集中在线粒体室中。两个非互斥的假设可能解释了米托坦与 MAM 的特定相互作用。首先，高度亲脂性分子米托坦可以直接进入 MAM 脂质膜。事实上，最近的一项工作表明，米托坦插入双层脂质膜，引起膜完整性的干扰和改变 。在后一项研究中，米托坦诱导的改变需要 PE 的存在，PE 是线粒体膜的主要成分，由 PISD 合成。此外，最近已经确定了 MAM 脂筏样微结构域。第二个假设依赖于这样一个事实，即米托坦可能与 TSPO（跨膜线粒体内胆固醇转运蛋白）结合，并且可能充当线粒体苯二氮卓受体拮抗剂，尽管在目前的工作中没有直接进行测定。事实上，米托坦是一种高度亲脂的化合物，显示出两个芳香环，大多数 TSPO 配体也是如此，包括苯二氮卓衍生物。为了进一步探索这一假设，H295R 细胞与米托坦和 PK11195（一种 TSPO 的高亲和力和选择性药理学抑制剂）共同孵育。我们显示了这两种分子在诱导 MAM 破坏和细胞凋亡以及抑制人肾上腺皮质细胞类固醇生成方面的协同作用。MAM 破坏，但当细胞用 10 μM 米托坦处理时未观察到细胞凋亡。因此，在米托坦给药的基础上靶向 TSPO 可能代表一种治疗 ACC 患者的有前景的药理学策略，能够增强米托坦的作用，同时减少米托坦的剂量并最大限度地减少潜在的副作用。

　　本研究还应有助于确定米托坦（mitotane）反应的预测因素。正如之前发表的那样，ACAT1 表达作为 MAM 的一个蛋白质成分，似乎是一个很有希望的反应预测因素，尽管这些初步观察结果需要进一步确认。FATE1 是一种在 ACC 中表达的癌症睾丸抗原，通过解偶联 MAM 来拮抗药物诱导的细胞凋亡，正如 Dohman-Bougherra等人最近证明的那样，并且也可能代表对米托坦耐药的有希望的因素。最后，代谢组学研究表明，天冬氨酸/谷氨酸比率构成了米托坦效率的特定标志，因此可以代表米托坦反应的早期标志物，尽管其潜在作用仍有待进一步探索。

　　总之，我们的结果将 MAM 确定为米托坦（mitotane）的重要细胞内靶标，使我们能够选择可以代表反应或抵抗预测因素的蛋白质。靶向 MAM 成分，如 ACAT1 或 TSPO 与米托坦相关或不相关，也可以构成治疗 ACC 患者的新方法。微信扫描下方二维码了解更多：