曲美替尼(trametinib)有效地杀死了RAS突变的婴儿ALL细胞

　　大多数（约 80%）婴儿急性淋巴细胞白血病 (ALL) 病例的特征在于涉及混合谱系白血病(MLL或KMT2A) 基因的染色体重排，这导致预后不良：无事件生存的机会为 30–最多 40%。我们和其他人表明亚克隆RAS突变发生在 14-36% 的MLL重排 ALL 病例中，这取决于MLL易位亚型。RAS突变进一步降低了生存机会，复发率很快，基本上没有生存机会。最近，我们发现 MEK 抑制剂在体外有效地杀死了RAS突变的婴儿 ALL 细胞，其中曲美替尼（trametinib）是测试的最有效的化合物。因此，我们提出曲美替尼可能有益于携带额外RAS突变的MLL重排婴儿 ALL 患者。在这里，我们报告了曲美替尼在RAS突变体MLL重排婴儿 ALL 小鼠异种移植模型中的临床前评估。

　　由于之前在小鼠模型中研究了曲美替尼治疗其他恶性肿瘤并被接受用于治疗BRAF突变型黑色素瘤、我们根据这些研究的给药方案，给予 5 mg/kg（低）或 30 mg/kg（高）在毒性评估中通过腹膜内注射每周 3 次使用曲美替尼（每组 n = 3 只小鼠）。一周内，30 mg/kg 曲美替尼组的 3 只小鼠中有 2 只死亡，而最后一只小鼠因体重减轻而被人道安乐死。载体和 5 mg/kg 曲美替尼剂量可耐受长达 28 天，没有不适或体重减轻的迹象（在线补充图 S1A）。其中一只曲美替尼小鼠比其同窝小鼠小，但没有迹象表明将其排除在研究之外。组织切片的苏木精和伊红 (HE) 染色显示高剂量曲美替尼诱导肾损伤，这在载体组和低曲美替尼组中不存在（在线补充图 S1B）。令人惊讶的是，高剂量曲美替尼还导致脾脏中骨髓细胞的丰度增加（在线补充图 S1C），类似于脾髓外造血（EMH）。此外，我们观察到接受低剂量曲美替尼的小鼠骨髓中的造血细胞耗竭，而这在载体治疗的小鼠中没有发生（在线补充图 S1D）。虽然无法获得高剂量曲美替尼的骨髓组织，但高剂量曲美替尼可能会引起更严重的骨髓耗竭，引起脾 EMH。

　　为了评估曲美替尼（trametinib）在体内的功效，我们将RAS突变体MLL重排的婴儿 ALL 细胞系 KOPN8（106 个细胞；尾静脉注射）移植到 NSG 小鼠中，该细胞系之前用荧光素酶报告基因转导（从这里开始称为如 KOPN8-SLIEW）。随后，通过活体成像评估了 1 周的植入。随机化后，载体或曲美替尼治疗（5 mg/kg，每周 3 次）开始，并通过每周活体成像跟踪白血病进展。在载体和曲美替尼治疗的小鼠中，系统性白血病在两周内发生，尽管在载体小鼠中更严重，最明显的是在第 14 天。活体成像的量化显示曲美替尼单药治疗延迟了白血病进展，但不足以防止白血病向外生长。曲美替尼对白血病进展的适度影响促使我们研究其作用机制是否在我们的模型中完全实现。因此，在处死小鼠前 4 小时（第 17 天），随机选择载体组的 2 只小鼠和曲美替尼组的 2 只小鼠接受曲美替尼推注（5 mg/kg），用于分析组织样本中的 ERK 激活之后。从所有小鼠中提取脾脏、骨髓和外周血样品。正如活体成像数据所预期的那样，两个治疗组均出现脾肿大，脾重没有显着差异。处理组织后，使用流式细胞术分析白血病细胞的存在。（例如门控，请参见在线补充图 S2B）。

　　大多数来自载体或曲美替尼（trametinib）处理的脾脏的细胞代表人类白血病细胞。然而，在 8 只接受曲美替尼治疗的小鼠中，有 4 只的骨髓抽吸物的白血病负荷降低至 10-30%，而其余小鼠的白血病骨髓与载体治疗组相似（80-95%）。此外，我们观察到与载体相比，曲美替尼治疗的小鼠外周血中的白血病细胞减少（分别为 12% 和 23%），尽管这种差异没有统计学意义。接受曲美替尼推注（蓝点）的小鼠与非推注小鼠相当。在骨髓抽吸物中观察到的双峰效应与性别、总重量或脾脏重量、外周血中的白血病细胞或年龄无关（在线补充图 S2C）。

　　为了进一步研究载体和曲美替尼治疗小鼠骨髓中的白血病细胞分布，我们对骨髓组织切片进行了 HE 染色。有趣的是，在载体骨髓中，我们观察到严重的白血病细胞浸润，而经曲美替尼治疗的小鼠的选定骨髓，白血病负荷降低，实际上显示出细胞不足。管这些低细胞骨髓与健康骨髓不同，但这可能是由于曲美替尼诱导的白血病细胞死亡而不是毒性，正如曲美替尼被批准用于转移性黑色素瘤和最近在其他血液疾病中的临床研究所表明的那样。

　　由于MLL重排婴儿 ALL 中的RAS突变与增强的中枢神经系统 (CNS) 浸润有关，我们研究了固定颅骨切片中白血病细胞的存在。有趣的是，曲美替尼显着减少了 3 只接受曲美替尼治疗的小鼠中的 2 只白血病浸润到软脑膜空间，而所有载体小鼠均出现细胞侵袭。

　　我们对脾脏和骨髓样品的蛋白质裂解物进行了电泳解析，并研究了作为曲美替尼（trametinib）疗效标志物的 ERK 去磷酸化。有趣的是，赋形剂非推注脾脏样品具有明显的 ERK 磷酸化 (pERK)，而接受推注的赋形剂小鼠的 pERK 信号显着降低。此外，曲美替尼通过连续注射曲美替尼（黑色条）和单次推注赋形剂组小鼠（白色条）抑制所有脾分离物中的 ERK 磷酸化，这通过量化这些印迹的相对 pERK 信号得到证实。此外，推注和非推注小鼠的骨髓样本（在通过磁激活细胞分选纯化之前；MACS）包含相当百分比的白血病细胞（在线补充图 S3A）。有趣的是，载体骨髓样品显示出与脾脏样品相似的 ERK 磷酸化模式，曲美替尼推注降低了 pERK 水平。而在曲美替尼组中，推注也伴随着 ERK 磷酸化的降低。对印迹进行量化显示，在非推注骨髓中，赋形剂组和曲美替尼组之间几乎没有差异，尽管推注曲美替尼有效地降低了 ERK 磷酸化。因此，如在脾中观察到的那样，连续的曲美替尼治疗不会导致持续的 pERK 降低，但推注曲美替尼会暂时降低骨髓中的 pERK 水平。

　　尽管先前证明 MEK 抑制在RAS突变型 BCP-ALL 异种移植模型中有效，但在我们的MLL重排婴儿 ALL 模型中，曲美替尼不能显着抑制白血病进展。然而，曲美替尼治疗确实会影响植入定位，特别是骨髓和RAS突变MLL重排 ALL 细胞的脑浸润。RAS突变型MLL重排 ALL 和 BCP-ALL之间 MEK 抑制功效的差异可能是由细胞遗传亚型和相关结果的差异来解释的。

　　有趣的是，普列托等人表明在人MLL重排 ALL 细胞系 SEM 的小鼠异种移植物中，KRASG12V 的异位表达显着促进了 CNS 浸润，这与我们的数据一起表明 MEK 抑制可能会减少 CNS 的参与。此外，MEK 抑制剂司美替尼显着减少了儿童RAS突变型 BCP-ALL 异种移植模型中的CNS 浸润。

　　曲美替尼组的脾源性白血病细胞显示持续降低的 pERK 水平，而弹丸注射曲美替尼（trametinib）也可以降低载体组的 pERK。此外，我们在曲美替尼治疗后 8 只小鼠中的 4 只观察到骨髓细胞不足，而在具有高度白血病骨髓的小鼠中，在接受曲美替尼推注后，ERK 磷酸化降低。可能是曲美替尼清除降低了其作用或替代信号机制恢复了 pERK，而且我们的给药频率太低，无法诱导持续抑制 ERK 磷酸化。虽然更频繁的给药可能会提高疗效，但存在毒性风险。然而，在患者来源的实体瘤异种移植物中的其他研究使用了每日口服给药方案（0.3-3 mg/kg），而我们选择腹膜内给药以更好地控制曲美替尼水平，

　　总之，尽管曲美替尼（trametinib）单药治疗无法在体内系统地抑制RAS突变的MLL重排 ALL，但一半小鼠的骨髓白血病负荷降低，并且曲美替尼有效降低了骨髓和脾脏白血病细胞中的 ERK 磷酸化。这说明了 MEK 抑制剂通过减少 CNS 浸润和可能增强糖皮质激素敏感性的潜在价值。微信扫描下方二维码了解更多：