维罗细胞(2.5 × 105细胞/孔), BHK21细胞(1.2 × 105细胞/孔)或原代猕猴肌腱成纤维细胞(传代 11、2 × 105细胞/孔),分别接种在96个孔板中,并在37°C下以0.005(Vero细胞)和0.002(BHK21和肌腱成纤维细胞)的MOI暴露于MAYV1小时。 然后将细胞彻底洗涤两次,随后加入100μL补充有药物的培养基,浓度在300至2.5μg/ mL和200至5μg/mL(每次稀释8孔)之间,分别用于法匹拉韦和利巴韦林。选定的MOI在48小时内持续感染并杀死所有细胞。16个未添加病毒的孔作为阴性对照。
将细胞培养物在37°C,5%CO2并使用结晶紫染色监测细胞活力,直到感染后72小时(HPI)。病毒抑制和50%抑制浓度(IC50%)使用Prism软件版本8.1(GraphPad软件,拉霍亚,加利福尼亚州,美国)计算。
在测定IC50%之前,在暴露后72小时使用结晶紫染色在各种细胞类型中测定MAYV原液滴度。使用Käber方法观察到的滴度为6.8×106;6.2 × 106;3.2 × 106TCID 50%/mL 分别用于 Vero-E6、BHK-21 和原代肌腱成纤维细胞。
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